"Znajdź i zamień" w DNA

Wszyscy znają narzędzie występujące w edytorach dokumentów: "znajdź i zamień". Możemy na przykład szybko zamienić każde występujące w tekście słowo "genomu" na "ciasta". Naukowcy z Yale i Harvard Medical School zrobili to samo, ale nie w dokumencie... a w DNA. Genetycy od dawna są zdolni do edycji pojedynczych genów, jednak tym razem udało się opracować metodę masowego wyedytowania DNA. Użyli tego narzędzia do rekodowania całego ("ciasta") genomu bakterii E.Coli.


Kolonie Escherichia coli (Pałeczka okrężnicy) na szalce 

Było to możliwe, ponieważ ten sam kod genetyczny jest podstawą całego życia na planecie. Kod składa się z 4 liter (nukleotydów), które tworzą rdzeń łańcucha DNA: A (adeniny),C (cytozyny),G (guaniny) i T (tyminy). Trzy "litery" tworzą kodon (triplet), kodujący jeden z aminokwasów, elementów składowych białek. Na przykład GCA koduje alaninę, TGT - cysteinę. Łańcuch nukleotydów przepisywany jest łańcuch aminokwasów, do momentu napotkania na kodon "STOP", oznaczający triplet przerywający pracę sunącej po nici mRNA maszynerii produkującej białko i oznaczający zakończenie podstawowego etapu produkcji białka. 

Kod jest taki sam dla każdego genu na planecie. U ludzi, roślin czy bakterii te same kodony odpowiadają tym samym aminokwasom (z drobnymi różnicami na przykład przy kodonach typu START u bakterii i archeonów). Kod zawiera jednocześnie wiele redundacji. "Litery" DNA mogą ułożyć się w 64 różne triplety, a mamy tylko 20 aminokwasów, kodony STOP i START. Tu dochodzimy do jednej z cech kodu genetycznego - degeneracji kodu DNA. Jeden aminokwas może być przez wiele kodonów (tripletów). Na przykład GCT, GCA, GCC i GCG kodują alaninę. Ta zmienność daje pole popisu do popisu dla genetyków, bo czasami zastosowanie określonego kodonu pociąga za sobą pewne skutki... 

Zespoły z Harvardu i Yale, kierowane przez Farrena Isaaca i Georga Churcha podmieniły kodony TAG na TAA w całym genomie bakterii E. Coli, powszechnie występującej w środowisku i będącej jednocześnie podstawowym mikrobem ("królikiem") doświadczalnym. Obydwa kodony oznaczają "STOP", więc dla bakterii teoretycznie nie ma żadnej różnicy. To tak jakby podmienić drogowy znak "stop" na taki sam, ale innej firmy ;). Ale nie to było celem - niewykorzystany, podmieniony kodon TAG  zostanie wykorzystany do zakodowania innego aminokwasu, spoza standardowej 20. Otwiera to nową drogę dla wielu zastosowań Stworzony organizm został nazwany GRO - genomically recoded organism.

Na razie zespół proponuje 3 zastosowania. Po pierwsze, dzięki przypisaniu kodonu do nowych aminokwasów, można produkować więcej białek, także tych nie wytwarzanych normalnie przez żywe organizmy. Można to wykorzystać do produkcji nowych typów leków czy materiałów, od polimerów dostarczających leki w określone miejsca w organizmie po powierzchnie antybakteryjne. Nowy aminokwas daje chemikom i inżynierom więcej opcji do osiągnięcia swoich celów. Rekodowane organizmy mogą być więc wykorzystane jako fabryki do produkcji materiałów o nowych i ekscytujących właściwościach - mówi Isaak.

Po drugie można użyć poprawiony kod genetyczny do stworzenia organizmów odpornych na wirusy. Ma to duże znaczenie dla przemysłu; dla przykładu firma biotechnologiczna GENZYME musiała zamknąć swój zakład na wiele miesięcy po skażeniu przez wirus, co spowodowało milionowe straty (wirus zaatakował hodowle komórkowe wykorzystywane do produkcji). Wirusy "rozmnażają się" przez przejęcie komórki ofiary i wykorzystują jej maszynerię do produkcji białek (niektórzy nawet porównują same wirusy do zarodników, a właściwą formą życia ma być przejęta przez wirus komórka). Wirusy są więc zależne - ich białka własne muszą być kodowane przez te same triplety, które wykorzystuje komórka-ofiara. Jeżeli gospodarz będzie korzystał z innego kodowania, to instrukcje wirusa staną się bezużyteczne - komórka będzie produkować zmienione, bezużyteczne dla niego białka. 

Zespół potwierdził, że zmienione mikroby są mniej podatne na przynajmniej jeden typ faga - typu wirusa atakującego bakterie. Co prawda nie były niepokonane, ale kolonie mogły dłużej przetrwać. Efekt był niewielki, ale zauważany. Kodon TAG jest rzadki (dlatego wzięto go na warsztat - mniej pracy przy podmienianu), występuje tylko na końcach genu. Ale przecież zarówno TAA jak i zamieniany TAA znajdują się w "słowniku" wirusa. Teoretycznie przed i po podmianie nie powinno być żadnych efektów. Jednak ich wystąpienie sugeruje, że kodujące teoretycznie to samo kodony dają inne właściwości. Większe zmiany mogą więc prowadzić do pełnej ochrony przed wirusami.

Po trzecie, zmieniony kod może być wykorzystywany przez organizmy modyfikowane genetycznie, chroniąc je przez krzyżowaniem się z "naturalnymi". To genetyczna wersja przypowieści o Wieży Babel - organizmy modyfikowane staną się więźniami własnych zmian, nie będą mogły wymieniać genów z naturalnymi odpowiednikami. Będą "mówiły" innym kodem.

Rekodowanie opiera sie na dwóch technologiach opracowanych przez zespół - MAGE, podmieniającej TAG na TAA w pociętych fragmentach genomu bakterii, oraz technologii CAGE, która poskładała pocięte i wyedytowane fragmenty w jeden genom nowego szczepu bakterii.

MAGE debiutowała dwa lata temu. Oznacza “multiplex automated genome engineering” i pozwala łatwo i szybko dokonywać wielu zmian w genach na masowa skalę. Pierwotnie była wykorzystywana do tworzenia milionów wariantów genomów bakteryjnych, które mogły być testowane pod kątem przydatności dla człowieka. Dlatego nazwano ją "maszyną ewolucyjną". W ciągu kilku dni maszyna wyewoluowała bakterię E. coli zdolną do produkcji dużych ilości likopenu, czerwonego i bardzo zdrowego barwnika pomidorów.

MAGE, genetyczna maszyna ewolucyjna

MAGE jest jednak wszechstronnym edytorem. Może nie tylko tworzyć wiele zróżnicowanych zmian w grupach komórek, ale też kreować specyficzne zmiany w pojedynczej komórce. I właśnie do tego wykorzystał ją tym razem zespół badawczy. Kodon TAG występuje w 321 miejscach genomu E.coli. Dla każdego miejsca zespół wytworzył mały fragment DNA, w którym TAG było zastąpione TAA (reszta pozostała bez zmian). Te fragmenty zostały przez maszynę "wklejone" losowo do bakterii, na mechanizmy ewolucyjne wybierały te, które u których wklejenie się powodło. Rezultat:  bakteria z częściowo  wyedytowanym genomem.

Tą drogą wyprodukowano 31 szczepów, różniących się podstawieniami TAA pod TAG w różnych miejscach. Może wydaje się to nadmiernie skomplikowane, jednak podmiana w jednym kroku byłaby nieefektywna, powolna i z wieloma błędami. Jeden błąd zniszczyłby cały projekt. Metodą małych kroków zespół mógł ominąć ten problem.

Aby połączyć 32 szczepy bakterii z częściową edycją w jeden z pełną, zespół opracował technologię CAGE (conjugative assembly genome engineering). Wykorzystuje koniugację bakterii, procesu podczas którego dwie bakterie łączą się i wymieniają materiałem genetycznym (taki substytut dla rozmnażania płciowego).

Poszczególne szczepy bakterii łączono w pary, tak aby każda strona dostarczyła swoją wersję zmian. 32 szczepy z 10 zmianami utworzyło 16 szczepów z 20 zmianami. I tak z 16 zrobiono, 8 a z 8 - 4 szczepy. Do koniugacyjnych półfinałów stawiły 4 szczepy E.coli, a każdy z nich posiadał 1/4 genomu z podmienionymi kodonami TAG. W finałach utworzyły one pojedynczy szczep, który posiadał jedynie kodony podmienione na TAA. Pozbyto się także czynnika RF1, białka rozpoznającego kodon TAG jako kodon STOP i wstrzymującego produkcję (pod ten kodon będzie można przypisać inną funkcję).

W uzyskanej bakterii wykryto 355 mutacji i namnażała się ona w normalnym tempie. Jej genom był wolny od TAG w swojej pierwotnej funkcji. Zespół będzie mógł więc przypisać do niego nowy aminokwas, a Isaac porównał to do metody "plug and play", ale z podpięciem nowej cząsteczki. Po tym przetestowano odporność bakterii na wirusy. Nie były co prawda całkowicie odporne, jednak do uzyskania takiego efektu trzeba podmienić wszystkie rodzaje kodonów STOP.

Co w przyszłości? Teraz zespół skupia się na "przegraniu" antysensownego kodonu TAG na sensowny, kodujący aminokwas. Jest to o wiele trudniejsze, niż to, co zrobiono wcześniej.  Zanim dokona się takiej zmiany, trzeba rozwikłać zagadkę włączania i wyłączania określonych genów, funkcji białek przez nie kodowanych, efektywności oraz regulacji ich produkcji  i wielu innych rzeczy.  A ponieważ geny bakteryjne nakładają się na siebie, zmiana w jednym kodonie pociągnie za sobą zmiany w wielu genach. Według współautora Marca Lajoie, to nie jest koniec listy. Trzeba brać pod uwagę mechanizmy i zjawiska, o których jeszcze nie wiemy.

Co więcej kodony sensowne (kodujące aminokwasy), występują o wiele częściej niż kodony STOP. E.coli ma 321 miejsc w których jest TAG. Dodając do tego następne w kolejce najrzadsze kodony - AGA i AGG, mamy ponad 5 000 zmian do wykonania. Jeżeli chcesz podmienić 13 tych najrzadszych (zespół określa je jako “forbidden codons”), trzeba zrobić 150 000 zmian... Bez pełnej automatyzacji raczej sie nie obejdzie. 

Aby sprawdzić wykonalność takiego założenia i jakie przyniesie to skutki dla bakterii, Lajoie i Siriam Kosuri próbowali rekodować "zakazane kodony", podmieniając je na zamienniki kodujące inny aminokwas. Zamiast działać na całym genomie E.coli (co zrobił poprzedni zespół), skupili się na 42 najważniejszych genach bakterii. Dzięki temu mieli do wykonania tylko 405 zmian zamiast 155 000.

Podmiana TAG w całym genomie to pierwszy krok i zakończył się on powodzeniem. W naszym badaniu w praktyce oczekiwaliśmy na porażkę - mówi Lajoie. Dzięki temu można zobaczyć, co może działać, a co nie i oszczędzić rozczarowań w przyszłości.

Wykazano, że 26 z 42 rekodowanych genów można wykorzystać - bakterie w tych przypadkach były zdolne do przeżycia, wzrastały średnio 20% wolniej niż normalne. Co ważne, każda z 405 zmian w 26 genach może być rekodowana indywidualnie, jak i w grupach. Wszystkie "zakazane kodony" można podmienić. 

Było to zaskakujące i bardzo zachęcające - mówi Lajoie. Oznacza to, że wszystkie z nich są podatne na usuwanie. Sukces czy porażkę będzie determinować specyficzność określonego genu, i to, czy będziemy w stanie sobie z tym poradzić.

Zachęcony wynikami zespół rozpoczął podmianę kodonów sensownych w całym genomie E.coli. To pozwoli zmienić ich technologię z technologicznego dema na praktyczne zastosowanie. Pozwoli to także zgłębić naturę naszego kodu genetycznego. W jaki sposób ewoluował, dlaczego posiada strukturę tripletową, z trzema literami nukleotydów? Do jakiego stopnia jest plastyczny? Jedynym sposobem, aby się przekonać, jest dokonanie fundamentalnych zmian i obserwowanie ich wyników - mówi Isaac. Dopiero zaczęliśmy dostrzegać sieć zależności, które leżą u podstaw funkcjonowania genomu. Nikt nie rozumie całej jego złożoności - dlatego  jest to takie trudne - dodaje Lajoie.

Jest to majstersztyk inżynierii genetycznej. Wykazano, że nie ma podstawowych barier dla rearanżacji kodonów. Jest to ćwiczenie w przezwyciężaniu małych przeszkód, a za każdą kryje sie technologia do opracowania - komentuje Chang Liu, bioinżynier  z University of California.

PODOBAŁO SIĘ? CHCESZ BYĆ NA BIEŻĄCO Z KOLEJNYMI ARTYKUŁAMI? 

>>POLUB NAS NA FACEBOOK<<

Tłumaczenie i opracowanie na podstawie phenomena.nationalgeographic.com, mgr Seweryn Frasiński

Genomically Recoded Organisms Expand Biological Functions. dx.doi.org/10.1126/science.1241459

Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential Genes. dx.doi.org/10.1126/science.1241460