Barwienie błękitem toluidynowym

Błękit toluidynowy jest jednym z barwników, stosowanych w laboratoriach. Przytaczamy technikę, w której jest on wykorzystywany.

Błękit toluidynowy [BT] - zastosowanie

Opis: komórki tuczne są znajdowane w tkance łącznej a ich cytoplazma zawiera ziarna (metachromatyczne) składające się z heparyny i histaminy. BT powinien wybarwić komórki tuczne na kolor czerwono-purpurowy (barwienie metachromatyczne) a tło na niebiesko (barwienie ortochromatyczne). Metachromazja (barwienie się metachromatyczne na kolor inny niż kolor barwnika) elementy tkanki barwią się na kolory inne niż pochodzący z roztworu co odnosi się do pH, zagęszczenia barwnika i temperatury podstawowego barwnika. Barwniki niebieskie czy fioletowe będą pokazywały czerwone zmiany, a czerwone barwniki będą pokazywały żółte zmiany z metachromatycznymi elmentami tkanki.

Utrwalanie: 10% formalina

Ciecia: parafinowe na 5um

Roztwory i reagenty:

BT roztwór podstawowy:

BT O (sigma) – 1g

70% alkohol – 100ml

mieszać do rozpuszczenia

NaCl (1%):

NaCl – 0,5g

woda destylowana – 50 ml

mieszać do rozpuszczenia (robić roztwór na bieżąco). Wyregulować pH na 2,0 – 2,5 używając lodowatego kwasu octowego lub HCl

BT roztwór reaktywny (pH 2,0 – 2,5):

BT roztwór podstawowy – 5ml

1% NaCl, pH 2,3 – 45ml

dobrze wymieszać. PH powinno utrzymywać się na ok. 2,3 ale poniżej 2,5.

Robić roztwór na bieżąco i pozbyć się go po użyciu. pH powyżej 2,5 spowodowałoby zmniejszenie kontrastu wybarwiania.

Procedura:

1. odparafinować i uwodnić fragmenty w wodzie destylowanej
2. 2. barwić fragmenty w reaktywnym roztworze BT przez 2-3 min
3. przemywać w wodzie destylowanej ( 3 powtórzenia)
4. odwodnić szybko przy użyciu 95% i 2 razy 100% alkoholu (10 zanurzeń each since barwnik zciemnieje szybko w alkoholu)
5. przemyć w dwumetylobenzenie (ksylem) lub jego pochodnym, 2 razy każdy po 3 min
6. przykryć szkiełkiem nakrywkowym przy użyciu żywicy, dla średniego zamocowania

Obserwacje:

komórki tuczne – fioletowe/czerwono-purpurowe

tło - niebieskie