Izolowanie i oczyszczanie białek

Wspomagając młodych naukowców w ich pracy w labie, redakcja biostrefa.net przygotowała kilka wskazówek merytorycznych dotyczących izolowania i oczyszczania białek.

Duża liczba białek jest wrażliwa na degradację (peptydazy komórkowe), dlatego izolację prowadzi się często wobec inhibitora peptydaz- PMSF oraz niskiej temperatury.

Produkcja dużych ilości białek rekombinowanych wymaga konstrukcji wektorów ekspresyjnych niosących jako wstawkę cDNA interesującego nas białka, z dołączonym znacznikiem, który umożliwa wydajną izolację metodami tzw. chromatograficznego powinowactwa.

Niestety, brak jest uniwersalnych metod oczyszczania wszystkich białek.

Etapy izolacji i oczyszczania białek związanych z chromatyną:

1. Izolacja chromatyny z wybranej tkanki.
2. Ekstrakcja białek związanych z chromatyną (zależnie od właściwości białek, dla słabiej związanych 0,3 M NaCl, dla tych związanych silniej 0,6-2 M NaCl).
3. Rozpuszczenie mieszaniny białek w TCA.
4. Oczyszczenie przy użyciu chromatografii jonowymiennej na kolumnach (Sephadex C-25).

Techniki analizy i puryfikacji białek:

1. Elektroforeza żelowa jednokierunkowa - stopień usieciowania żelu umożliwia frakcjonowanie białek wg ich rozmiaru (masy). Mieszanina białek rozpuszczona w detergentach (np. SDS, który nadaje ładunek), z dodatkiem ME, DTT (niszczą mostki S-S).
2. Elektroforeza dwukierunkowa, 2DE - rozdzielenie białek względem masy oraz punktu izoelektrycznego.
3. Chromatografia

• Filtracja żelowa (sączenie molekularne)
• Jonowymienne
• Powinowactwa

4. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (sacharozy)

5. Spektroskopia masowa

Techniki chromatograficzne:

1. Filtracja żelowa - kolumny z Sephadex, Sepharose. Małe białka wnikają do środka ziaren złoża i zatrzymują się na kolumnie, duże przepływają.
2. Jonowymienna - wykorzystuje powinowactwo białek wobec złoża (jego wypadkowy ładunek elektryczny jest inny dla każdego białka).

Kolumny:

Dodatnio naładowane złoże (DEAE-celuloza) wyłapuje białka obdarzone „-„

Ujemnie naładowane złoże (CM-celuloza) wyłapuje białka „+”

3. Powinowactwa:

a) Kowalencyjne przyłączenie grupy X (np. glukoza)

b) Nałożenie mieszaniny białek na kolumnę

c) Przemycie buforem (ma za zadanie usunąć białka niezwiązane)

d) Elucja białek związanych

Np. konkanawalina - roślinne białko, które wiąże się z glukozą (większość innych białek nie wykazuje powinowactwa do glukozy i przepływa przez kolumnę). Konkanawalina uwalniana jest z kolumny poprzez przepłukanie stężonym roztworem glukozy.

Ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy:

Metoda ta wykorzystuje współczynnik sedymentacji [S], który jest charakterystyczny dla poszczególnych białek. Białka podczas wirowania przemieszczają się zgodnie z gradientem, ale zależnie od charakterystycznych dla siebie współczynników sedymentacji. Metoda ta zależna jest od masy białka, jego formy przestrzennej, kształtu, a także gęstości.

Opracowanie: K.T.

Photos Selected by freepik